Teori: Baggrund


For at kunne forstå teorien som ligger til grund for en biosensor er det vigtigt at du har styr på nogle generelle mikro/molekyler biologisk principper, begreber og metoder. Du behøver ikke forstå emnerne helt i dybden, men blot have et kendskab til dem. Denne side indeholder den nødvendige baggrundsteori du skal have kendskab til at kunne forstå hvordan en biosensor virker og hvordan man laver én. God læselyst!



1. Det centrale dogme - ‘in a nutshell’  fra hvad er DNA og gener

Det centrale dogme inden for biologien beskriver den genetiske informationsvej, som alle organismer følger. Generne er kodet som DNA og afskrives efter behov til RNA i transskriptionen. mRNA oversættes i translationen til det protein, som genet koder for. Proteiner deltager i næsten alle vigtige processer i cellerne.

DNA er dobbeltstrenget og består af fire forskellige nukleotider, der forkortes A, T, G og C. De baseparrer som A-T og C-G. mRNA er en enkeltstrenget afskrift af gener, som cellen har behov for. mRNA består af nukleotiderne A, U, G og C. Genteknologi gør det bl.a. muligt at ændre DNA og dermed både at slette gener og at indsætte nye eller ændrede gener.


Biotech Academy har tidligere lavet en video som forklarer det centrale dogme, transskription og translation. Du kan finde dem her: Det centrale dogmetransskription og translation.


2. Cellefabrikker

Cellefabrikker dannes grundlæggende ved at flytte de gener, der instruerer en celle i at producere et interessant stof, over til en mikroorganisme ved hjælp af moderne genteknologi. Mikroorganismen producerer derefter det eksempelvis værdifulde medicinske stof, både sikkert og i store mængder. I Biosensor skal i selv være med til at designe jeres helt egen cellefabrik.


Genet for det interessante stof bliver i cellen transkripteret fra DNA til mRNA, som videre translateres til et protein som om, det var cellens eget. Man kan derfor få skabt både komplicerede proteiner af naturens sande eksperter i proteinsyntese og vigtige biologiske stoffer som eksempelvis penicillin, kodimagnyl eller enzymer.


Cellefabrikker kan være attraktive af flere årsager. Måske bliver stoffet (produktet) kun naturligt produceret i meget små mængder af en organisme, der lever under nogle ekstreme forhold, som ikke er mulige at efterligne.


Rekombinant produktion i cellefabrikker har haft en stor betydning fra midten af 1980’erne. Teknologien betyder fx, at det i dag ikke længere er nødvendigt at udvinde insulin til behandling af sukkersyge fra slagtede svin eller køers bugspytkirtler. I dag produceres insulin af cellefabrikker i store tanke. Insulin fra køer og svin ligner oven i købet ikke humant insulin helt og kan derfor bl.a. give allergiske reaktioner.


Takket være cellefabrikker er det heller ikke nødvendigt at udtrække væksthormon fra menneskehjerner til børn med vækstmangel; insulin og væksthormon er i dag to af mange proteiner, som gensplejsede mikroorganismer producerer rent og sikkert.


Celletype

Grundlæggende handler designet af en ny cellefabrik om at udvælge og indsætte et fremmed gen i en organisme. Her bliver genet udtrykt som en række af aminosyrer der udgør et protein og i denne sammenhæng et produkt. De mindre prokaryote organismer er bl.a. bakterierne. De har den fordel, at de er simplere og hurtigere at arbejde med. I cellefabrikker, hvor man kan nøjes med en prokaryot organisme, kan valget fx falde på bakterierne Escherichia coli (E. Coli) eller Bacillus subtilis, der er simple, effektive og nemme arbejdsorganismer. I Biosensor vil i arbejde med E. coli.


Ekspressionsvektor / Plasmid

Det fremmede gen der skal indsættes i E. coli findes selvfølgelig ikke færdigt sammensat nogen steder i naturen. Genets proteinkodende område (fra start-codon til stop-codon) også kaldt CDS, er ikke nok til at få cellen til at producere det kodende protein, det kræver hjælp fra en række hjælpesekvenser.


Før det proteinkodende område, skal der være et gen aktiverende element, og efterfølgende et element, der slukker genet. Disse regulerende områder kaldes promoter, ribosombindingssted (RBS) og terminator. Som set i figuren herunder, får vi sammenlagt et gen indeholdende det proteinkodende område og de nævnte regulerende områder.


Genelementer

Figur 2.1: Det proteinkodende område af et gen (fra start-codon til stop-codon) har hjælpe sekvenser på begge sider som styrer reguleringen af genet.


Derudover, for nemt at kunne koble vores gen sammen med disse nødvendige hjælpesekvenser, eksisterer der en række forskellige, færdiglavede ekspressionsvektorer. De er cirkulære DNA-sekvenser (plasmider) og indeholder to ekstra områder, et replikations ori (ORI) og en selektionsmarkør som er nødvendige for at sikre en god produktion af genets protein. Vores samlede gen (blå) kan blot sættes ind i ekspressionsvektoren som set i figuren herunder.


Ekspressionsvektor

Figur 2.2: En ekspressionsvektor er et cirkulært DNA (plasmid), der indeholder de nødvendige dele til at udtrykke et ønsket gen i en given celle (ekspression). Det blå element dækker både over genet og de regulerende sekvenser, såsom promoter, RBS og terminator. Replikations ori er nødvendig for, at ekspressionsvektoren kopieres til cellens datterceller


Vores proteinkodende gen indsættes i en færdig ekspressionsvektor ved brug af restriktionsenzymer og ligase. Restriktionsenzymerne bruges kort og godt til at klippe plasmidet i stykker så vi kan indsætte vores gen og lime plasmidet sammen igennem med ligase. Endelig har vi en ekspressionsvektor indeholdende:

  1. Vores gen
  2. Selektionsmarkør
  3. Replikations Ori
I afsnittet Genetisk tuning vil vi gå mere i dybden med elementerne der udgør ekspressionvektoren og er med til at regulere produktionen af vores gen, dvs. promoter, terminator, RBS, ORI.


Cellefabrikken i relation til Biosensor

For at lave en biosensor skal man bruge en værtsorganisme. I Biotech Academy’s biosensor kit skal du arbejde med E. coli, da denne bakterie er nem at arbejde med. En biosensor indeholder et biosensor plasmid, som er en ekspressionsvektor. Biosensor plasmidet indeholder genelementer/hjælpesekvenser som gør bakterien fungere som en biosensor, men mere om dette i Biosensor teorien.


3. Genetisk tuning / Genregulering

Cellen har tusindvis af gener, så derfor er den nødt til at styre, at kun de nødvendige gener er aktive. Ved at forstå genreguleringens tænd/sluk-mekanismer kan de efterlignes til at tune en celle, så den producerer mere af det ønskede produkt!

Det er ikke sikkert, at en ny cellefabrik producerer særlig meget af det ønskede stof. Et eksempel er fx miljøvenligt biobrændstof, som forskere forsøger at producere ved at indsætte de nødvendige enzymer i mikroorganismer, der gerne skulle omdanne fx affald til bio-ethanol! Gener aflæses med forskellig styrke, som afhænger af genets regulering. Det gælder også et indsat gen, der instruerer cellen i at danne dens produkt, fx et nødvendigt enzym i dannelse af insulin eller bio-ethanol.

Den stigende forståelse for genreguleringen har gjort det muligt at skrue op for de interessante gener og derved 'tune' cellen til at producere øgede mængder. Og på samme måde kan vi også skrue ned for de uønskede gener i cellen eller helt fjerne dem.


Genregulering - Genernes tænd/sluk-knapper

Mange gener er kun nødvendige i særlige situationer og har derfor behov for en skarp regulering af deres ekspression (udtryk). Nogle bakterier bærer eksempelvis særlige selvmordsgener, som selvsagt ikke skal udtrykkes normalt, mens andre gener hjælper til som forsvar på varmechok, og derfor kun skal udtrykkes som beskyttelse ved høje temperaturer.


Som nedenstående figur viser, vil DNA’et for ét gen typisk indeholde mange flere elementer end blot den proteinkodende region. Særligt de omkringliggende elementer deltager i genreguleringen.


Regulatorisk genelementer

Figur 3.1: Oversigt over nødvendige, regulerende dele for gen-ekspression. Det ses desuden, om de er til stede på DNA-, mRNA og protein-niveau. Længderne på figuren svarer ikke til de aktuelle længder. RBS: Ribosombindingssted. ATG: Startcodon. TAG: Stopcodon.



Promoter: øgning af genets transskription

Når et protein fra et gen skal bruges i cellen, bliver transskriptionen af genets DNA aktiveret. Der dannes nu mRNA og dermed protein. Kort inden den protein-kodende region af genet sidder der på DNA-strengen en bestemt sekvens kaldt en promoter, der netop har den opgave at hjælpe med at aktivere transskriptionen. Gener, der altid bruges, har meget stærke promotere, som gør at generne altid er tændte og transskripteres. Omvendt findes promotere, der kun aktiveres i ganske særlige situationer, hvor genet er nødvendigt. Det kunne eksempelvis være, hvis cellen får et varmechok og skal beskytte sig. Genteknologien gør det muligt at udvælge lige den promoter, der passer godt til at aktivere det producerende gen i en bestemt cellefabrik.



Promoterens biologiske virkningsmekanisme

DNA'et der udgør en promoter, kan tiltrække helt særlige proteiner, der binder til promoteren. Disse proteiner kaldes transkriptionsfaktorer. Transkriptionsfaktorer kan være meget specialiserede til bestemte promoterer, hvor de kan binde til en helt speciel DNA- sekvens. Transkriptionsfaktorerne er kun til stede i cellen, når der er behov for transskription af de pågældende gener. Binding af disse transskriptionsfaktorer til promoteren på DNA'et er nemlig med til at guide enzymet RNA-polymerase til også at binde DNA'et, så det kan begynde at transskriptere DNA'et til mRNA. En sådan transskriptionfaktor kaldes også en aktivator.

I genetisk optimering af en cellefabrik er det som udgangspunkt smart at vælge en kraftig promoter, der fører til produktion af meget protein og dermed det ønskede produkt. En promoter, der altid fører til transskription af DNA’et, kaldes konstitutiv. Men disse promotere er ikke altid de smarteste at anvende til at styre transskriptionen i en cellefabrik. Man kan nemlig ikke forhindre genet i at blive transskripteret hele tiden. Cellerne går straks i gang med at producere proteinet, selv mens de er i deres begyndende vækstfase, hvor ressourcerne måske hellere skal spares til først at skabe flere celler, inden selve produktionen af proteinet startes.

En anden promotertype kaldes inducibel, fordi bestemte forhold skal til for at starte transskriptionen. Det kan enten være fysiske betingelser (fx lav/høj temperatur) eller kemiske betingelser (fx tilstedeværelsen af et bestemt stof). En inducibel promoter kan derfor være smart at bruge med produktionsgenet i en cellefabrik. Det er især klogt, hvis produktet ligefrem har en giftig påvirkning af værtscellen. Med en inducibel promoter, kan man vente med at aktivere genet, til rigtig mange celler er vokset frem.


Termination af transskription

Det kan være klogt at tilføje en terminator-sekvens lige efter genet, der koder for proteinproduktet. En terminator sørger for at transskriptionen ophører, når RNA-polymerase når frem til den på sin vej hen ad DNA'et. Uden en terminator risikerer man også at få transskripteret så meget af den efterfølgende, irrelevante DNA-kode fra ekspressionsvektoren, at det forstyrrer cellen. Det ekstra mRNA som følger med kan også gøre mRNA'et meget ustabilt og letnedbrydeligt.


Ribosomal binding site (RBS) hjælper med genets translation

Translationen af mRNA til protein kan også øges genetisk. Inden selve den protein-kodende sekvens på mRNA’et (dvs. inden startcodonet) sidder der nemlig en sekvens, hvor ribosomet kan binde sig, denne sekvens kaldes ribosomal binding site (RBS). Der er forskel på typerne mellem eukaryoter og prokaryoter, men fælles er, at ribosomet her bindes inden, det bevæger sig hen til startcodonet og begynder selve proteinsyntesen. Ved at vælge bestemte RBS'er kan det lade sig gøre at opnå en bedre ribosombinding og dermed bedre translation af mRNA’et til protein.


Start- og stopcodon

Det første codon, der translateres til et protein, er altid startcodonet med mRNA-koden AUG. AUG koder for aminosyren methionin (T i DNA erstattes som bekendt af U i mRNA). I princippet begynder alle proteiner derfor med methionin. Tre af de 64 forskellige codons koder ikke for en aminosyre, men er i stedet stopcodons: DNA-koderne UAG, UGA og UAA får translationen af mRNA'et til at ophøre.


Flere kopier af genet afgøres af ORI sekvensen

Hvis et gen findes i flere kopier i cellen, øges også muligheden for at lave mere mRNA af det, og dermed øges også hvor meget protein der i sidste ende dannes. Når genet sidder i en ekspressionsvektor, afgøres genets antal kopier i cellen af den Ori-sekvens (Origin of replication), der er sat i vektoren. DNA-replikationen starter nemlig ved Ori, og der findes både stærke og svage af disse sekvenser. Nogle Ori-sekvenser giver fx kun én kopi af ekspressionsvektoren i cellen, mens andre stærke Ori kan give omkring 200 kopier i hver celle. Inden man så nu skynder sig at vælge den kraftigste Ori-sekvens, skal man være opmærksom på, at cellens vækst sænkes af at producere rigtig mange kopier, så produktionen måske slet ikke bliver større alligevel!


Vigtigt at huske om Genregulering

En cellefabrik kan optimeres genetisk ved at bruge forskellige tricks, der ofte ændrer ved genreguleringen. Genregulering er en meget vigtig egenskab, der hele tiden sørger for, at kun de nødvendige gener udtrykkes. Det er vigtigt at vælge en egnet promoter til rekombinant produktion. Promoteren er en slags startknap til genets transkription og findes i forskellige typer og styrker.




4. Genteknologiske værktøjer

Restriktionsskæring

Restriktionsenzymer (eller restriktions-endonukleaser) findes i hundredvis af varianter, der hver skærer DNA-strenge over ved en bestemt sekvens som typisk er 4-8 nukleotider lang, fx AGATCT. Restriktionsenzymerne var et guldfund for forskerne pga. muligheden for at skære DNA over ved en præcis sekvens. Denne præcise skæring af DNA kan bruges sammen med sammenklæbningsenzymet DNA-ligase til populært sagt at klippe og klistre DNA og dermed gener sammen. Kendskabet til disse enzymer betød gensplejsningens fødsel og gjorde det bl.a. muligt at producere de første rekombinante proteiner.


Restriktionsenzymerne virker ved at skære det dobbeltstrengede DNA over, typisk skråt, så der skabes enkeltstrengede ender (sticky ends) (se figur 1). Sticky ends har som navnet antyder en slags klistrende evne, da de komplementære, enkeltstrengede ender gerne vil finde tilbage til hinanden og genetablere deres indbyrdes tiltrækkende hydrogenbindinger ved almindelig baseparring. Denne tiltrækning eksisterer naturligvis ikke for de ligeskårne blunt ends, så det kan være svært at vide, hvordan de sad sammen før skæring.


Sticky Ends

Figur 4.1: Restriktionsenzymer kender oftest palindromiske sekvenser og efterlader to identiske "sticky ends".


Den sekvens, som restriktionsenzymerne genkender, er ofte palindromisk. Det vil sige, at sekvensen ved skæringsstedet er ens på begge strenge blot set fra hver sin retning.


Eksempler på brug af restriktionsskæring

Metoden med at 'klippe/klistre' med restriktionsenzymer og DNA-ligase kan fx bruges til at sætte en proteinkodende DNA-sekvens (et gen) ind i en ekspressionsvektor, når man skal lave en celle, der producerer et nyt protein. Det kræver simpelthen, at der sidder de samme skæringssekvenser der, hvor den proteinkodende DNA-sekvens og ekspressionsvektoren skal klippes op og sættes sammen.


Transformation

Optagelsen af fremmed DNA til en organisme kaldes transformation. Metoderne for hvordan transformationen udføres varierer fra organisme til organisme. I biosensor øvelsen skal du indsætte en ekspressionsvektor (biosensor plasmidet) E.Coli. For at udføre transformationen skal anvende heat-shock transformationsmetoden (også kaldet kemisk kompetence). Med heat-shock transformationsmetoden behandles cellerne kemisk med fx calcium-ioner (Ca2+), nu kaldes cellerne kemisk kompetente. Når kemisk kompetente celler udsættes for et varme/heat-shock åbnes membranen kortvarigt og ekspressionsvektorer kan optages i cellen. E. coli bakterier kan også transformeres ved elektroporation. Her udsættes en blanding af DNA og celler for et kortvarigt elektrisk felt i en elektroporator, hvormed cellemembranen bliver permeabel. Nogle af cellerne vil derved optage DNA’et og blive transformerede. Cellerne vil efterfølgende være skrøbelige og skal derfor håndteres skånsomt, indtil de er "kommet sig".


Selektion og screening

Selektion er en udvælgelse af bestemte genetisk forandrede celler (mutanter), fx efter en gensplejsning. I gensplejsning vil typisk kun en lille andel af cellerne faktisk blive gensplejset som ønsket. For at undgå at skulle teste en masse forkerte celler, kan man bruge selektion.

Ved selektion skaber man et miljø for cellerne, hvor kun celler med et bestemt selektionsgen kan vokse, fx et resistensgen til antibiotika. Dette selektionsgen sætter man ind sammen med det nye gen under gensplejsningen. Selektionsgenet bliver på den måde en markør for, at gensplejsningen er lykkedes. Dette skyldes, at kun de rigtigt gensplejsede celler vil kunne overleve sammen med det valgte antibiotikum. Princippet er en positiv selektion, da de interessante celler, der selekteres for, netop overlever.

Antibiotikaresistens er en populær selektionsform. Den kan bruges fx i bakterier, der er følsomme over for et antibiotikum. Man skal kende et selektionsgen for resistens, der fjerner denne følsomhed. Ampicillin og kanamycin er eksempler på forskellige antibiotika, man genetisk kan give resistens overfor.


Selektion

Figur 4.2: Selektion med antibiotikum for at udvælge de gensplejsede celler. Kun de gensplejsede celler bærer selektionsgenet, som giver dem resistens overfor antibiotikumet. På vækstpladen med antibiotikum vil kun disse celler gro frem. Uden antibiotikum på pladen ville celler, der ikke blev gensplejset, også kunne gro frem.


Screening er en metode til at kunne genkende bestemte genetiske mutanter, fx efter en gensplejsning/transformation, hvor man vil kunne udvælge en celle, der er korrekt gensplejset. I modsætning til selektion, hvor kun de rigtigt gensplejsede mutanter vil gro frem, kan screening foregå ved at de transformerede celler fx får en grøn eller rød farve.


Biotech Academy har tidligere lavet en video som forkalerer gensplejsningsteknikker. Du kan finde den her: Gensplejsning.


5. Etik og lovgivning

Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, fx hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder.


Ifølge lovgivningen skal genmodificerede planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny GM-plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der bl.a. bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den i pagt med forsigtighedsprincippet ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed.


Etiske holdninger til genspljening

Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution. Visse religiøse mennesker opfatter brugen af gensplejsning som at 'lege Gud' og er derfor stærke modstandere.


I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi.




6. Ordforklaringer

  • Cellefabrik          

    • En cellefabrik er en celle der producerer et værdifuldt produkt, oftest som følge af gensplejsning.

  • DNA

    • DNA lagrer alle cellers arvemateriale (generne) i lange dobbeltstrenge af nukleotiderne A,T,C og G. Det er rækkefølgen af disse der afgør hvilket protein, genet koder for.

  • DNA polymerase

    • En enzymtype, der kan kopiere DNA i en proces kaldet replikation.

  • Ekspressionsvektor        

    • En ekspressions-vektor er DNA, der indeholder de hjælpende DNA-elementer (promoter, terminator etc) der skal til for at udtrykke genet i en organisme. Læs meget mere i 3 Genetisk tuning.

  • Ekspression       

    • I biologi er ekspression, når et gen aktiveres og derfor fører til dannelse af mRNA og sidenhen protein.

  • Antibiotikum

    • Et antibiotikum er et stof der virker imod bestemte mikroorganismer, som enten dræbes eller hæmmes i vækst.

  • mRNA  

    • mRNA (messenger RNA) er en RNA-type. Den dannes ved transkription af de gener, der er aktive, og bruges i translationen til at danne protein.

  • Restriktionsenzym         

    • Et restriktionsenzym (eller restriktionsendonuklease) er i stand til at skære en DNA-dobbeltstreng over ved en bestemt sekvens.

  • Screening           

    • Screening er en metode, der kan bruges til at kende særlige genetiske varianter fra de andre.

  • Selektion            

    • Selektion er en metode, hvor man etablerer nogle forhold for organismerne, som gør at de interessante overlever og dermed udvælges. Læs mere.

  • Transskription    

    • Transskription er en proces, hvor aktive gener afskrives fra DNA'et til mRNA, som kan bruges i cellen til translation.

  • Translation         

    • Translation er en proces, hvor mRNA oversættes til protein i et ribosom. Hver codon (tre nukleotider) oversættes til en aminosyre efter den genetiske kode.


Kilder

Ovenstående tekst er udpluk fra Jesper Vinds artikler: 

  • "Hvad er DNA og gener?"
  • "Cellefabrikker: Den bioteknologiske rute fra DNA til protein"
  • "Genetisk tuning af cellefabrikker"
  • "Genteknologisk værktøjer (PCR, gelelektroforese og mere"
  • "Etik og lovgivning i genteknologi"
  • "Ordforklaringer"

Artiklerne kan findes i deres fulde længde på Biotech Academy's eller ved at klikke her.