Case 1

Der findes flere forskellige typer af biosensorer, som anvender enzymer, antistoffer eller biomolekyler til at detektere det ønskede stof. Med Biotech Academys Biosensor kit kan du lave såkaldte “helcellebiosensorer”. En helcellebiosensor er en bakterie eller en anden organisme, som kan detektere et input og respondere med et output. Det kan bruges i mange sammenhænge f.eks. medicinske eller miljømæssige. Man kan bruge mange forskellige organismer som vært til en helcellebiosensor. Det kan f.eks. være gær eller E. coli. En Biosensor kan blandt andet benyttes til at detektere forurenende stoffer såsom fenantren i et økosystem. En anden type biosensor kan de- tektere riboflavin, som er et essentielt vitamin i kroppen. Hvis du er interesseret i at lære mere om biosensorer i den virkelige verden, kan du læse mere på hjemmesiden (her). 

I Biotech Academys Biosensor Case 1 øvelse skal du lave en helcellebiosensor, som vil  fluorescere rødt. Øvelsen har til hensigt at lære dig om transformation af bakterier, samt give dig praktisk erfaring, med at arbejde med GMO-organismer og de sikkerhedsforanstaltninger, der hører med. Du vil også få en forståelse for biologiens centrale dogme, altså forholdet mellem DNA, mRNA og protein.

En helcellebiosensor er som sagt en celle, som kan sanse tilstedeværelsen af et bedstemt stof i dens omgivelser. I Biosensor Case 1 kan din biosensor ikke sanse noget, men vil altid være aktiv. Det kan stadigvæk være en god øvelse at lave Case 1, da de teknikker som du kommer til at bruge er nogle helt grundlæggende laboratorieteknikker, som man bruger i næsten alt GMO-arbejde.

I videoen forneden kan du se en kort beskrivende video, der forklare hvad Biosensor Case 1 øvelsen går ud på.

Biosensor Case 1 from Biotech Academy on Vimeo.

Hvis du ønsker at læse teorien som en pdf kan du downloade teorien her (opdateret d. 13/2 2020).

Her kommer et kort resume af den teori, som du skal bruge for at forstå Biosensor Case 1 øvelsen. Vi foreslår at du skimmer dette og stopper op, hvis der er noget, der ikke virker bekendt. Vi har markeret de vigtige begreber med fed, så specielt opmærksom på, om du kender dem. Som du måske ved, er der forskel på hvordan prokaryote (bakterier) og eukaryote (planter, svampe og dyr) organismer fungerer. I følgende opfriskning snakker vi kun om prokayoter, da du i Biosensorøvelsen skal arbejde med en bakterie.
 
Vi begynder med det centrale dogme, som starter med, at DNA oversættes til mRNA. Denne proces kaldes transskription og varetages af mange forskellige proteiner bl.a. RNA-polymerasen. Næste skridt er en proces der ud fra mRNA-strengen, laves et protein. Denne proces kaldes translation og varetages af bakteriens ribosomer, der ved hjælp af tRNA-molekyler sammensætter proteinet, aminosyre for aminosyre, med mRNA som skabelon, indtil det færdige protein frigives fra ribosomet til bakteriens cytoplasma.
 
Figur 1. Opbygningen af et gen i en prokayote organisme, for eksempel en E. coli bakterie. Du kan se at genet består af de fire genelementer: en promoter, et ribosomalt bindingssted, den kodende sekvens og en terminator. Rækkefølgen på de fire genelementer er meget vigtig for at bakterien kan producere det protein som den kodende sekvens koder for.

Gener er de områder i bakteriens DNA, som gennem det centrale dogme, bliver oversat til protein. De fleste gener i prokayoter har den samme overordnede opbygning: en promoter, et ribosomalt bindingssted, en kodende sekvens og en terminator. Figur 1 viser opbygningen af et typisk gen i prokayoter. Her kommer en lille oversigt over, hvad de enkelte genelementers funktion er:

  • Promoteren er det sted, hvor RNA-polymerasen binder sig til DNA-strengen og starter syntesen af mRNA-strengen. Der findes forskellige typer af promotere. Nogle er altid aktive, dvs. at proteinet, som dette gen koder for, hele tiden vil blive produceret. Andre promotere bliver reguleret, og er dermed kun aktive under bestemte forhold, eksempelvis ved den rette temperatur eller under tilstedeværelsen af et bestemt molekyle. Regulering af promotere lærer du mere om, hvis du laver Biosensor Case 2 øvelsen.
  • Ribosomalt bindingssted (RBS) er det sted, hvor ribosomet binder til mRNA- strengen og begynder at syntetisere proteinet, som genet koder for. Translationen stopper, når ribosomet når frem til et stopcodon, som er det sidste codon i den kodende sekvens, se næste punkt.
  • Den kodende sekvens er den sekvens af DNA nukleotider, som dikterer sekvensen af mRNA-strengen og dermed proteinets aminosyresammensætning og rækkefølge. Det er altså den kodende sekvens, som bestemmer, hvilket protein som genet koder for. Den kodende sekvens starter, med et startcodon, ATG, hvor der indsættes aminosyren metheonin og slutter med et stopcodon, TAG, TAA eller TGA, hvor der ikke indsættes nogen aminosyre. Det færdige protein kommer således til at bestå af den aminosyresekvens, som DNA-sekvensen fra startcodon, inden stopcodon koder for.
  • Terminatoren stopper transskriptionen ved at vise RNA-polymerasen, at genet er slut. Når RNA-polymerasen når frem til terminatoren slipper den DNA-strengen og frigiver mRNA-strengen til bakteriens cytoplasma.
Det kan godt være svært at forstå, hvilke genelementer som hører til transskriptionen, og hvilke som hører til translationen. Man kan huske det ved, at de yderste genelementer, promoteren og terminatoren, bruges i det første skridt i det centrale dogme, nemlig transskriptionen. De inderste genelementer, det ribosomale bindingssted og den kodende sekvens bruges under translationen, som er det andet skridt i det centrale dogme.
 
DNA findes i forskellige former dels som lange kromosomer, der indeholder størstedelen af organismens gener. Bakteriers kromosomer er ofte et langt ringsluttet stykke DNA som er tilfældigt foldet over tusind gange cellens cytoplasma, i modsætning til eukaryoter, hvis kromosomer ofte er lineære DNA-stykker som er præcist viklet op omkring histon proteiner. Udover kromosomet indeholder bakterier plasmider, som er kortere ringsluttede stykker DNA, hvor bakterierne også har gener. Når man vil indføre et gen til en bakterie, er det ofte en fordel at indsætte genet i et plasmid og derefter indsætte plasmidet i bakterien.
 
Ligesom bakteriens kromosom skal plasmider replikeres for at de kan blive givet videre til bakteriens datterceller, når bakterien deler sig. Dette forgår ved en proces som hedder DNA-replikation. Replikationsprocessen starter ved origin of replication (ori), som er et genelement som findes på plasmidet. ori giver bakterien mulighed for at replikere plasmidet, fordi det fungerer som startsted for DNA-polymerasen. Her kan DNA-strengen åbne op og lade bakteriens replikationsmaskineri (DNA-polymerase, helicase, primase osv.) begynde replikationen af plasmidet. Det betyder, at når plasmidet er inde i en bakteriecelle, vil bakterien kopiere plasmidet. Hvis du kunne tænke dig at få genopfrisket, hvordan DNA-replikationen fungerer, kan du se Biotech Academys Biostriben video her.
 
Forhåbentlig virkede det ovenstående resumé bekendt. Vi har lavet en liste over emner og begreber som derudover er gode at have styr på inden du laver Biosensorøvelsen:
  • Det centrale dogme
  • Kendskab til E.coli bakterier som modelorganisme
  • Plasmid
  • Varmeshock transformation
  • Genelementer: Promoter, ribosomalt bindingsted (RBS), den kodende sekvens,  terminator og replikations origin (ori)
  • Genregulering
  • Antibiotika og brugen af antibiotika som selektionsmarkør

Disse emner bør du kunne læse om i din Bioteknologibog eller kigge på projektet “Moderne genteknologi” som du kan du kan finde her. Biotech Academy’s Biostriben har også tidligere lavet videoer som forklarer nogle af emnerne. Dem kan du finde her:

I Biosensor Case 1 øvelsen skal du indsætte gener i en E. coli bakterie. Der findes forskellige måder at indsætte DNA i bakterier. Først og fremmest kan man indsætte en DNA-sekvens direkte i bakteriens kromosom. Alternativt kan man benytte sig af et plasmid, som bærer DNA-sekvensen. I denne øvelse skal du bruge et plasmid, som vi kalder Case 1 plasmidet, hvorpå der ligger to gener. Det ene gen koder for et rødt fluorescerende protein, mens det andet er et kloramfenikolresistensgen. Hvis du tager et kig på genet for det rødt fluorescerende protein (rfp) på figur 2, ser du, at genet består af de fire genelementer, som blev beskrevet i begyndelsen. Det samme gør sig gældene for kloramfenikolresistensgenet.

Figur 2. Plasmidkort over Case 1 plasmidet. Det ses at plasmidet indeholder 2 gener, samt et replikations origin (ori). Genet for det rødt fluorescerende protein (rfp) er forstørrede så du kan se opbygningen af det.

På Biosensor Case 1 plasmidet findes også et replikationsstartsted (ori), der bliver genkendt af bakteriens DNA-polymeraser, og som her starter DNA-replikationen af plasmidet. Således bliver der lavet flere kopier af biosensorplasmidet inde i bakterien. Når der er flere kopier af plasmidet, vil der altså være flere kopier af genet for det rødt fluorescerende protein. Det betyder, at flere RNA-polymeraser samtidigt kan transskribere genet, så der bliver produceret mere af det rødt fluorescerende protein. Forskellige ori kan give forskellige kopital (det gennemsnitlige antal kopier af et plasmid i hver bakterie). Nogle ori giver kun få kopier (1-10 plasmider pr. bakterie), mens andre som f.eks. det i Biosensor Case 1 plasmidet er blevet estimeret til at give 200-300 kopier i hver bakterie.

Genet for det rødt fluorescerende protein gør bakterien i stand til at lave et protein, som får bakterien til at blive rød. Man siger, at bakterien udtrykker det rødt fluorescerende protein. Genet bliver udtrykt, ved at RNA-polymerasen binder sig til promoteren og begynder transskriptionen af DNA-strengen, indtil den når frem til terminatoren og mRNA-strengen frigives. På mRNA-strengen findes nu et ribosomalt bindingssted og den kodende sekvens. Derfor kan bakteriens ribosomer binde sig til det ribosomale bindingssted og begynde translationen af den kodende sekvens fra startcodon til stopcodon. Det resulterer i en kæde af aminosyrer, som folder op i en tertiær struktur til det færdige rødt fluorescerende protein, som gør bakterien rød (se figur 3).

Figur 3: Genet for det rødt fluorescerende protein indeholder en konstitutiv promoter, og derfor vil det rødt fluorescerende protein hele tiden blive produceret. Figuren viser, hvordan RNA-polymerasen transskriberer den kodende sekvens for det rødt fluorescerende protein (rfp). Herefter sætter et ribosom sig på mRNA- strengen ved det ribosomale bindingsted og begynder translationen. Aminosyre sekvensen for det rødt fluorescerende protein folder sig op i en tertiær struktur. Når der er produceret en tilstrækkelig mængde af rødt fluorescerende protein, vil bakterien blive rød.

Det andet gen som findes på Case 1 plasmidet, koder for kloramfenikolresistens. Dette gen bliver udtrykt på samme måde som det rødt fluorescerende protein, men der bliver i stedet lavet et kloramfenikolresistensprotein. Når bakterien har dette protein inden i sig, er den i stand til at overleve i omgivelser med antibiotikummet kloramfenikol. Et antibiotikaresistensgen, som kloramfenikolresistensgenet, kaldes for en selektionsmarkør, da det muliggøre at selektere (udvælge), de bakterier, som har optaget Case 1 plasmidet frem for de bakterier, som ikke har. Hvordan du kommer til at bruge selektion i biosensorøvelsen, kommer vi ind på senere.

Optagelsen af fremmed DNA i en bakterie kaldes transformation.

Figur 4: Transformationen af bakterier foregår i flere trin: Figur 4.1. Behandling af bakterierne med kalcium-ioner.

Metoderne for, hvordan transformationen udføres, varierer mellem forskellige bakterier. I Biosensor Case 1 øvelsen skal du indsætte et plasmid (Case 1 plasmidet) i en E. coli bakterie. For at udføre transformationen skal du anvende varmeshock transformationsmetoden. Med denne metode behandles bakterierne først med kalcium-ioner (Ca2+), for at gøre dem kemisk kompetente (se figur 4.1). Dernæst tilsættes plasmidet til de kemisk kompetente bakterier, og de udsættes for et varmeshock, som resulterer i, at plasmidet bliver optaget i nogle af de kompetente bakterier (se figur 4.2). De bakterier, som har optaget biosensorplasmidet kaldes transformanter.

Nu har du en blanding af bakterier, som har optaget Case 1 plasmidet (transformanter), og bakterier som ikke har optaget plasmidet. Sidstnævnte kaldes vildtypebakterier, fordi de ikke har optaget nogle nye gener og altså har den oprindelige genotype. Denne blanding kalder vi for transformationsblandingen. Mekanismen for hvordan varmeshocket virker, er endnu ikke opklaret. Man har blot fundet ud af, at det øger transformationseffektiviteten, altså hvor mange af de kompetente bakterier, som optager plasmidet.

Transformanterne begynder nu at replikere biosensorplasmidet via ori (se figur 4.3).

Figur 4.2. Bakterierne udsættes for et varmeshock som hjælper bakterierne med at optage biosensorplasmidet.

Efter varmeshocket tilsættes LB-medium, som er et nærings- og energiholdigt vækstmedium. Det får alle bakterierne (både transformanterne og vildtypebakterierne) til at vokse og dele sig (se figur

4.4). Transformanterne begynder også at syntetisere det rødt fluorescerende protein og kloramfenikolresistensproteinet, ud fra generne på Case 1 plasmidet (se figur 4.5). Det tager dog lang tid før, der er produceret nok rødt fluorescerende protein til, at det kan ses med det blotte øje.

Næste skridt er at selektere (udvælge) transformanterne. Det gøres ved at udplade transformationsblandingen på en LB-agar plade med kloramfenikol tilsat. Transformanterne kan overleve, fordi de udtrykker kloramfenikolresistensproteinet, mens vildtypebakterierne vil blive dræbt af kloramfenikolen. Hvis transformationsblandingen blev udpladet på en LB-agar plade uden kloramfenikol, ville der vokse en blanding af transformanter og vildtypebakterier på LB-agar pladen. Det ville gøre det svært at udvælge transformanterne til viderearbejde (se figur 5).
Selektionmarkører er derfor særligt smarte, hvis genet ikke gør det nemt for dig at se forskel på bakterier,
Figur 4.3 Biosensorplasmidet bliver replikeret i transformanten.
hvor transformationen er lykkedes, og hvor 
den ikke er.
 

I videoen forneden kan du se hvordan man laver en Biosensor.

Sådan laver du en biosensor from Biotech Academy on Vimeo.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figur 4.4 Transformanten deler sig.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figur 4.5 Det rødt fluorescerende protein bliver udtrykt fra genet på Biosensorplasmidet og efter noget tid bliver transformanterne røde.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figur 5: Forskellen på at bruge selektion og ikke at bruge selektion. Det kan være rigtig svært at finde de bakterier som har optaget det ønskede DNA (transformanterne) på en LB-agar plade uden antibiotika. På figuren ses transformationsblandingen, som består af bakterier med og uden biosensorplasmidet (hhv. transformanter og vildtypebakterier) samt to forskellige LB-agar plader med og uden kloramfenikol. På pladen uden kloramfenikol vokser transformanter (røde pletter) og vildtypebakterier (det cremefarvede lag som omgiver de røde plette) imellem hinanden, det gør det svært at udtage transformanterne, da bakterier er meget små. På pladen med kloramfenikol er det kun transformanterne som kan vokse og det er derfor nemt at udtage dem til brug i andre eksperimenter eller tests.
 
 
 
 
 

Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, for eksempel hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder [1].

Ifølge lovgivningen skal genmodificerede planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny gen-modificeret plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der blandt andet bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed, dette kaldes også for forsigtighedsprincippet.
Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution \cite{wind}. Nogen opfatter brugen af gensplejsning som at ‘lege Gud’ og er derfor stærke modstandere. Hvis du ønsker at læse mere om bioetik, findes der blandt andet et etik interview med teolog Mickey Gjerris og professor Kasper Lippert-Rasmussen der har et meget forskelligt synspunkt på brugen af GMO [2].

I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi.

[1] Jesper Wind. Moderne genteknologi. https://www.biotechacademy.dk/ undervisning/gymnasiale-projekter/moderne-genteknologi/, 2000.

[2] Det etiske råd. Etikinterview om gmo. http://www. etiskraad.dk/etiske-temaer/natur-klima-og-foedevarer/ undervisning-til-gymnasieskolen/gmo/etikinterview, 2011.

Her finder I de øvelsesvejledninger der skal benyttes til Biosensor Case 1 øvelsen.

Biosensor Case 1 Øvelsesvejledningen skal benyttes af både underviser og elever: 

Du som underviser skal også benytte følgende vejledninger: 

Her finder I opgaver der er lavet specifikt til Biosensor Case 1 øvelsen.

Her finder I det flowsheet der lavet specifikt til Biosensor Case 1 øvelsen. 

Her på siden kan du finde et dokument der indeholder information omkring de tekniske deltaljer i Case 1 øvelsen. Dokumentet beskriver de forskellige elementer der indgår i Case 1 plasmidet såsom backbone samt indhold i reportergenet og aktivatorgenet, man kan selv vælge om man vil benytte dokumentet til undervisningen. 

Det skal dog siges at indholdet i dette dokument ikke er noget som eleverne bør vide for at forstå øvelsen, det kan dog være interessant for den ekstra interessede elev at kigge nærmere på de forskellige elementer  plasmidet og hvor de stammer fra. 

Man kan downloade dokumentet her (opdateret d. 6/11 2019).

Scroll til toppen

Vi bruger cookies for at kunne give dig den bedste oplevelse. Ved at bruge vores side accepterer du brugen af cookies.