Case 1

Der findes flere forskellige typer af biosensorer, som anvender enzymer, antistoffer eller biomolekyler til at detektere det ønskede stof. Med Biotech Academys Biosensor kit kan du lave såkaldte “helcellebiosensorer”. En helcellebiosensor er en bakterie eller en anden organisme, som kan detektere et input og respondere med et output. Det kan bruges i mange sammenhænge f.eks. medicinske eller miljømæssige. Man kan bruge mange forskellige organismer som vært til en helcellebiosensor. Det kan f.eks. være gær eller E. coli. Disse biosensorer kan benyttes til at detektere forurenende stoffer såsom fenantren i et økosystem. En anden biosensor kan detektere riboflavin, som er et essentielt vitamin i kroppen. Hvis du er interesseret i at læse mere om biosensorer i den virkelige verden kan du læse mere på hjemmesiden (her). 

I Biotech Academys Biosensor Case 1 øvelse skal du lave en helcellebiosensor som vil være rødt fluorescerende. Øvelsen har til hensigt at lære dig om transformation af bakterier, samt give dig praktisk erfaring med at arbejde med GMO-organismer og de sikkerhedsforanstaltninger der hører med. Du vil også få en forståelse for biologiens centrale dogme, altså forholdet mellem DNA, mRNA og protein. En helcellebiosensor er som sagt en celle som kan sense tilstedeværelsen af et bedstemt stof i dens omgivelser. I Biosensor Case 1 kan din biosensor ikke sense noget, men vil altid være aktiv. Det kan stadigvæk være en god øvelse at lave Case 1, da de teknikker som du kommer bruge er nogle helt grundlæggende laboratorieteknikker, som man bruger i næsten alt GMO-arbejde.

I videoen forneden kan du se en kort beskrivende video, der forklare hvad Biosensor Case 1 øvelsen går ud på.

Biosensor Case 1 from Biotech Academy on Vimeo.

Her kommer et kort resume af den teori, som du skal bruge for at forstå Biosensor Case 1 øvelsen. Som du måske ved er der forskel på hvordan prokayoter (bakterie) og eukayoter organismer (planter, svampe og dyr) fungerer. I følgende opfriskning snakker vi kun om prokayoter, da du i Biosensorøvelsen skal arbejde med en bakterie. Vi begynder med det centrale dogme, som starter med at DNA oversættes til mRNA. Denne proces kaldes transskription og varetages af mange forskellige proteiner bl.a. RNA-polymerasen. Næste skridt er at der ud fra mRNA-strengen laves et protein. Denne proces kaldes translation og varetages af bakteriens ribosomer, som ved hjælpe af tRNA molekyler sammensætter proteinet aminosyre for aminosyre, indtil det færdige protein frigives fra ribosomet til bakteriens cytoplasma.

Gener er de områder i bakteriens DNA som, gennem det centrale dogme, bliver omsat til protein. De fleste gener i prokayoter har den samme overordnede opbygning: en promoter, et ribosomalt bindingssted, en kodende sekvens og en terminator. Figur 1 viser opbygningen af et typisk gen i prokayoter. Her kommer en lille oversigt over, hvad de enkelte genelementers funktion er:

  • Promoteren er det sted hvor RNA-polymerasen binder sig til DNA-strengen og starter transskriptionen af mRNA-strengen. Der findes forskellige typer af promotere, nogle er altid aktive, dvs. at proteinet, som dette gen koder for, hele tiden vil blive produceret. Andre promotere bliver reguleret, og er dermed kun aktive under bestemte forhold, eksempelvis ved den rette temperatur eller under tilstedeværelsen af et bestemt molekyle. Regulering af promotere lærer du mere om, hvis du laver Biosensor Case 2 øvelsen. 
  • Ribosimalt bindingssted (RBS) er det sted, hvor ribosomet binder til mRNA-strengen og begynder at translatere proteinet, som genet koder for. Translationen stopper, når ribosomet når frem til et stopcodon, som er det sidste codon i den kodende sekvens, se næste punkt. 
  • Figur 1. Opbygningen af et gen i en prokayote organisme, for eksempel en E. coli bakterie. Du kan se at genet består af de fire genelementer: en promoter, et ribosomalt bindingssted, den kodende sekvens og en terminator. Rækkefølgen på de fire genelementer er meget vigtig for at bakterien kan producere det protein som den kodende sekvens koder for.
    Den kodende sekvens er den sekvens af DNA nukleotider som dikterer sekvensen af mRNA-strengen og dermed proteinets aminosyresammensætning og rækkefølge. Det er altså den kodende sekvens som bestemmer, hvilket protein som genet koder for. Den kodende sekvens starter med et startcodon, ATG, og slutter med et stopcodon. Det færdige protein kommer således til at bestå af den aminosyresekvens som DNA-sekvensen mellem start og stopcodon koder for.
  • Terminatoren stopper transskriptionen ved at fortælle RNA-polymerasen, at genet er slut. Når RNA-polymerasen når frem til terminatoren slipper den DNA-strengen og frigiver mRNA-strengen til bakteriens cytoplasma.

Det kan godt være svært at forstå, hvilke genelementer som hører til transskriptionen, og hvilke som hører til translationen. Man kan huske det ved, at de yderste genelementer, promoteren og terminatoren, bruges i det første skridt i det centrale dogme nemlig transskriptionen. De inderste genelementer, ribosomalt binding sted og den kodende sekvens bruges under translationen, som er det andet skridt i det centrale dogme.

DNA findes i forskellige former dels som store kromosomer, der indeholder størstedelen af organismens gener. Bakteriers kromosomer er ofte et langt ringsluttet stykke DNA, i modsætning til eukayoter, hvis kromosomer ofte er et linært stykke DNA. Udover kromosomet indeholder bakterier plasmider, som er korte ringsluttede stykker DNA. Bakterier kan have gener på plasmiderne lige som på kromosomet. Når man vil tilføje et gen til en bakterie, er det ofte en fordel at indsætte genet i et plasmid og derefter indsætte plasmidet i bakterien. Vi har indsat de nødvendige gener ind i et plasmid, så når du laver Biosensorøvelsen, bliver din rolle at indsætte plasmidet i bakterien og teste, om de indsatte gener har den ønskede effekt, for eksempel bliver bakterien rød?.

For at få lavet så mange kopiere af plasmidet som muligt indeholder plasmidet også et replikations origin (ori). Det betyder, at når plasmidet er inde i en bakteriecelle, vil bakterien kopiere plasmidet. ori giver bakterien mulighed for at replikere plasmidet, fordi det fungerer som start sted for DNA-polymerasen. Her kan DNA-strengen åbne op og lade bakteriens replikationsmaskineri (DNA-polymerase, helicase, primase osv.) begynde replikationen af plasmidet. Hvis du kunne tænke dig at få opfrisket hvordan replikationen fungerer på kan se Biotech Academy’s Biostriben video her.

Forhåbentligt virkede det ovenstående resume bekendt. Vi har lavet en liste over emner og begreber som derudover er gode at have styr på inden du laver Biosensorøvelsen:

  • Det centrale dogme
  • Kendskab til E. coli bakterier som modelorganisme
  • Plasmid
  • Varmeshock transformation
  • Genelementer: Promoter, ribosomalt. bindingssted (RBS), den kodende sekvens, terminator og replikations origin (ori)
  • Genregulering
  • Antibiotika og brugen af antibiotika som selektionsmarkør

Disse emner bør du kunne læse om i din Bioteknologibog eller kigge på projektet “Moderne genteknologi” som du kan du kan finde her.

Biotech Academy’s Biostriben har også tidligere lavet videoer som forklarer nogle af emnerne. Dem kan du finde her:

I Biosensor Case 1 skal du indsætte gener i en E. coli bakterie. Der findes forskellige måder at indsætte DNA i bakterier. Først og fremmest kan man indsætte et DNA-sekvens direkte i bakteriens kromosom. Alternativt kan man benytte sig af et plasmid, som bærer DNA sekvensen. I denne øvelse skal du bruge et plasmid, som vi kalder Case 1 plasmidet, hvor på der ligger to gener. Det ene gen koder for et rødt fluorescerende protein, mens at det andet er et kloramfenikolresistensgen. Hvis du tager et kig på genet for det rødt fluorescerende protein på figur 2, ser du, at genet består af de fire genelementer som blev beskrevet i begyndelsen. Det samme gør sig gældene for kloramphenikolresistensgenet.
Figur 2. Plasmidkort over Case 1 plasmidet. Det ses at plamidet indeholder 2 gener, samt et replikations origin (ori). Genet for det rødt fluorescerende protein er forstørrede så du kan se opbygningen af det.

På Case 1 Biosensor plasmidet findes også et origin of replication (ori), der bliver genkendt af bakteriens DNA-polymeraser, som starter replikationen af plasmidet her. Således bliver der lavet flere kopier af biosensor plasmidet inde i bakteriens. Når der er flere kopier af plasmidet, vil der altså være flere kopier af genet for det rødt fluorescerende protein. Det betyder at flere RNA-polymeraser samtidigt kan transskribere genet. Dermed vil der blive produceret mere af det rødt fluorescerende protein, jo flere kopier af plasmidet der er i bakterien. Forskellige ori kan give forskellige kopital (antal af kopier af et plasmider i hver bakterie) nogle giver kun få kopier (1-10 plasmider pr. bakterie), mens andre som f.eks. det i Case 1 Biosensor plasmidet er blevet estimeret til at give 200 – 300 kopier i hver bakterie.

Genet for det rødt fluorescerende protein gør bakterien i stand til at lave et protein, som for bakterien til at blive rød. Man siger at bakterien udtrykker det rødt fluorescerende protein. Genet bliver udtrykt ved at RNA-polymerasen binder sig til promoteren og begynder transskriptionen af DNA-strengen indtil den når frem til terminatoren og mRNA-strengen frigives. På mRNA-strengen findes nu et ribosomalt bindingssted og den kodende sekevens. Derfor kan bakterien ribosomer binde sig til det ribosomale bindingssted og begynde translationen af den kodende sekvens fra start codon til stop codon. Det resulterer i en kæde af aminosyre som folder op i en tertiær struktur til det færdige rødt fluorescerende protein, som gør bakterien rød (se figur 3).

Figur 3. Genet for det rødt fluorescernde protein indeholder en konstitutiv promoter og derfor vil det rødt fluorescerende protein hele tiden blive produceret. Det sker genne det centrale dogme som illustreret på figuren.

Det andet gen som finde på Case 1 plasmidet koder for kloramfenikolresistens. Dette gen bliver udtrykt på samme måde som det rødt fluorescerende protein, men der bliver i stedet lavet et kloramfenikolresistensprotein. Når bakterien har dette protein inde i sig, er den i stand til at overleve i omgivelser med antibiotikummet kloramfenikol. Et antibiotikaresistensgen, som kloramfenikolresistensgenet, kaldes for en selektionsmarkør, da det muligør at selektere (udvælge) de bakterier som har optaget Case 1 plasmidet frem for de bakterier, som ikke har. Hvordan du kommer til at bruge selektion i Biosensorøvelsen kommer vi ind på senere.

Optagelsen af fremmed DNA ind i en bakterie kaldes transformation. Metoderne for hvordan transformationen udføres, varierer mellem forskellige bakterier. I Biosensor Case 1 øvelsen skal du indsætte et plasmid (Case 1 plasmidet) i en E. coli bakterie.

For at udføre transformationen skal du anvende varmeshock transformationsmetoden. Med varmeshock transformationsmetoden behandles bakterierne først med kalcium-ioner (Ca2+), for at gøre dem kemisk kompetente (se figur figur 4.1). Dernæst tilsættes plasmidet til de kemisk kompetente bakterier og de udsættes for et varmeshock, som resulterer i at plasmidet bliver optaget i nogle af de kompetente bakterier (se figur 4.2).

Nu har du altså en blanding at bakterier som har optaget Case 1 plasmidet og bakterier som ikke har. Mekanismen for hvordan varmeshocket virker, er det endnu ikke opklaret, man har blot fundet ud af, at det øger transformationseffektiviteten, altså hvor mange af de kompetente bakterier som optager plasmidet. Bakterierne, som har optaget Case 2 plasmidet begynder nu at replikere det via ori (se figur 4.3). Efter varmeshocket tilsættes LB-medium som indeholder en masse næring og energi, som bakterierne kan bruge til at vokse og dele sig (se figur 4.4). Ligeledes begynder bakterierne også at syntetisere det rødt fluorescerende protein og kloramfenikolresistensproteinet ud fra generne på Case 1 plasmidet (se figur 4.5). Det tager dog lang tid før end at det er produceret nok rødt fluorescerende protein til, at det kan ses med det blotte øje.

Figur 4. Transformationen af bakterier foregår i flere trin. Figuren her vise hvad der sker inde i bakterien på hvert trin processen.
Figur 5. Forskellen på at bruge selektion og ikke at bruge selektion. Det kan være rigtig svært at finde de bakterier som har optaget det ønskede DNA på en LB-agarplade uden antibiotika.

Næste skridt er at selektere (udvælge) de bakterier som har optaget plasmidet. Det gøres ved at udplade bakterierne på en LB-agarplade med kloramfenikol tilsat. Bakterierne som har optaget Case 1 plasmidet kan overleve, fordi de udtrykker kloramphenikolresistensproteinet, mens at bakterier som ikke har optaget Case 1 plasmidet vil dø.

Hvis blandingen af bakterier blev udpladet på en LB-agarplade uden kloramfenikol, ville der vokse en blanding af bakterier med og uden Case 1 plasmidet på LB-agarpladen (se figur 5). Selektionmarkører er derfor særligt smarte, hvis genet ikke gør det nemt for dig at se forskel på bakterier hvor transformationen er lykkes og hvor den ikke er.

Dette er tilfældet i Biosensor Case 2 øvelsen, da alle bakterierne vil være hvide efter transformationen.

I videoen forneden kan du se hvordan man laver en Biosensor. 

Sådan laver du en biosensor from Biotech Academy on Vimeo.

Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, for eksempel hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder [1].

Ifølge lovgivningen skal genmodificerede planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny gen-modificeret plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der blandt andet bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed, dette kaldes også for forsigtighedsprincippet.
Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution \cite{wind}. Nogen opfatter brugen af gensplejsning som at ‘lege Gud’ og er derfor stærke modstandere. Hvis du ønsker at læse mere om bioetik, findes der blandt andet et etik interview med teolog Mickey Gjerris og professor Kasper Lippert-Rasmussen der har et meget forskelligt synspunkt på brugen af GMO [2].

I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi.

[1] Jesper Wind. Moderne genteknologi. https://www.biotechacademy.dk/ undervisning/gymnasiale-projekter/moderne-genteknologi/, 2000.

[2] Det etiske råd. Etikinterview om gmo. http://www. etiskraad.dk/etiske-temaer/natur-klima-og-foedevarer/ undervisning-til-gymnasieskolen/gmo/etikinterview, 2011.

Her finder I de øvelsesvejledninger der skal benyttes til Biosensor Case 1 øvelsen.

Biosensor Case 1 Øvelsesvejledningen skal benyttes af både underviser og elever: 

Du som underviser skal også benytte følgende vejledninger: 

Her finder I opgaver der er lavet specifikt til Biosensor Case 1 øvelsen.

Her finder I det flowsheet der lavet specifikt til Biosensor Case 1 øvelsen. 

Scroll til toppen

Vi bruger cookies for at kunne give dig den bedste oplevelse. Ved at bruge vores side accepterer du brugen af cookies.