Case 1
Der findes flere forskellige typer af biosensorer, som anvender enzymer, antistoffer eller biomolekyler til at detektere det ønskede stof. Med Biotech Academys Biosensor kit kan du lave såkaldte “helcellebiosensorer”. En helcellebiosensor er en bakterie, eller en anden organisme, som kan detektere et input og respondere med et output. Det kan bruges i mange sammenhænge f.eks. medicinske eller miljømæssige. Man kan bruge mange forskellige organismer som vært til en helcellebiosensor , som f.eks. være gær eller E. coli. En Biosensor kan blandt andet benyttes til at detektere forurenende stoffer såsom fenantren i et økosystem. En anden type biosensor kan detektere riboflavin, som er et essentielt vitamin i kroppen. Hvis du er interesseret i at lære mere om biosensorer i den virkelige verden, kan du læse mere på hjemmesiden (her).
I Biotech Academys Biosensor Case 1 øvelse skal du lave en helcellebiosensor, som vil fluorescere rødt. Øvelsen har til hensigt at lære dig om transformation af bakterier, samt give dig praktisk erfaring med at arbejde med GMO-organismer og de sikkerhedsforanstaltninger, der hører med. Du vil også få en forståelse for biologiens centrale dogme, altså forholdet mellem DNA, mRNA og protein.
En helcellebiosensor er en celle, som kan sanse tilstedeværelsen af et bestemt stof i dens omgivelser. I Biosensor Case 1 kan din biosensor ikke sanse noget, men vil altid være aktiv. Det er stadigvæk en god øvelse at lave Case 1, da de teknikker som du kommer til at bruge er nogle helt grundlæggende laboratorieteknikker, som man bruger i næsten alt GMO-arbejde.
Hvis du ønsker at læse teorien som en pdf kan du downloade teorien her (opdateret d. 16/11 2020).
Gener er de områder i bakteriens DNA, som gennem det centrale dogme, bliver oversat til protein. De fleste gener i prokayoter har den samme overordnede opbygning: en promoter, et ribosomalt bindingssted, en kodende sekvens og en terminator. Figur 1 viser opbygningen af et typisk gen i prokayoter. Her kommer en lille oversigt over, hvad de enkelte genelementers funktion er:
- Promoteren er det sted, hvor RNA-polymerasen binder til DNA-strengen og påbegynder syntesen af mRNA-strengen. Der findes forskellige typer af promotere. Nogle er altid aktive, dvs. at proteinet, som dette gen koder for, hele tiden vil blive produceret. Andre promotere bliver reguleret, og er dermed kun aktive under bestemte forhold, eksempelvis ved den rette temperatur eller under tilstedeværelsen af et bestemt molekyle. Regulering af promotere lærer du mere om, hvis du laver Biosensor Case 2 øvelsen.
- Ribosomalt bindingssted (RBS) er det sted, hvor ribosomet binder til mRNA- strengen og begynder at syntetisere proteinet, som genet koder for. Translationen stopper, når ribosomet når frem til et stopcodon, som er det sidste codon i den kodende sekvens (se næste punkt).
- Den kodende sekvens er den sekvens af DNA nukleotider, som dikterer sekvensen af mRNA-strengen og dermed proteinets aminosyresammensætning og rækkefølge. Det er altså den kodende sekvens, som bestemmer, hvilket protein genet koder for. Den kodende sekvens starter med et startcodon, ATG, hvor der indsættes aminosyren methionin ( forkortet Met eller M) og slutter med et stopcodon, TAG, TAA eller TGA, hvor der ikke indsættes nogen aminosyre. Det færdige protein kommer således til at bestå af den aminosyresekvens, som DNA-sekvensen fra startcodon til stopcodon koder for.
- Terminatoren stopper transskriptionen ved at vise RNA-polymerasen, at genet er slut. Når RNA-polymerasen når frem til terminatoren slipper den DNA-strengen og frigiver mRNA-strengen til bakteriens cytoplasma.
- Det centrale dogme
- Kendskab til E.coli bakterier som modelorganisme
- Plasmid
- Varmeshock transformation
- Genelementer: Promoter, ribosomalt bindingsted (RBS), den kodende sekvens, terminator og replikations origin (ori)
- Genregulering
- Antibiotika og brugen af antibiotika som selektionsmarkør
Disse emner bør du kunne læse om i din Bioteknologibog eller kigge på projektet “Moderne genteknologi” som du kan du kan finde her. Biotech Academy’s Biostriben har også tidligere lavet videoer som forklarer nogle af emnerne. Dem kan du finde her:
I Biosensor Case 1 øvelsen skal du indsætte gener i en E. coli bakterie. Der findes forskellige måder at indsætte DNA i bakterier. Først og fremmest kan man indsætte en DNA-sekvens direkte i bakteriens kromosom. Alternativt kan man benytte sig af et plasmid, som bærer DNA-sekvensen. I denne øvelse skal du bruge et plasmid, som vi kalder Case 1 plasmidet, hvorpå der ligger to gener. Det ene gen koder for et rødt fluorescerende protein, mens det andet er et ampicillinresistensgen. Hvis du tager et kig på genet for det rødt fluorescerende protein (rfp) på figur 2, ser du, at genet består af de fire genelementer, som blev beskrevet i begyndelsen. Det samme gør sig gældende for ampicillinresistensgenet.
På Biosensor Case 1 plasmidet findes også et replikationsstartsted (ori), der bliver genkendt af bakteriens DNA-polymeraser, og som påbegynder DNA-replikationen af plasmidet. Således bliver der lavet flere kopier af biosensorplasmidet inde i bakterien. Når der er flere kopier af plasmidet, vil der altså være flere kopier af genet for det rødt fluorescerende protein. Det betyder, at flere RNA-polymeraser samtidigt kan transskribere genet, så der bliver produceret mere af det rødt fluorescerende protein. Forskellige ori kan give forskellige kopital (det gennemsnitlige antal kopier af et plasmid i hver bakterie). Nogle ori giver kun få kopier (1-10 plasmider pr. bakterie), mens andre som f.eks. det i Biosensor Case 1 plasmidet er blevet estimeret til at give 200-300 kopier i hver bakterie.
Genet for det rødt fluorescerende protein gør bakterien i stand til at lave et protein, som får bakterien til at blive rød. Man siger, at bakterien udtrykker det rødt fluorescerende protein. Genet bliver udtrykt, ved at RNA-polymerasen binder sig til promoteren og begynder transskriptionen af DNA-strengen, indtil den når frem til terminatoren og mRNA-strengen frigives. På mRNA-strengen findes nu et ribosomalt bindingssted og den kodende sekvens. Derfor kan bakteriens ribosomer binde sig til det ribosomale bindingssted og begynde translationen af den kodende sekvens fra startcodon til stopcodon. Det resulterer i en kæde af aminosyrer, som folder op i en tertiær struktur til det færdige rødt fluorescerende protein, som gør bakterien rød (se figur 3).
Det andet gen som findes på Case 1 plasmidet, koder for ampicillinresistens. Dette gen bliver udtrykt på samme måde som det rødt fluorescerende protein, men der bliver i stedet lavet et ampicillinresistensprotein. Når bakterien har dette protein inden i sig, er den i stand til at overleve i omgivelser med antibiotikummet ampicillin. Et antibiotikaresistensgen, som ampicillinresistensgenet, kaldes for en selektionsmarkør, da det muliggøre at selektere (udvælge) de bakterier, som har optaget Case 1 plasmidet frem for de bakterier, som ikke har. Hvordan du kommer til at bruge selektion i Biosensorøvelsen, kommer vi ind på senere.
Videoen nedenfor giver en oversigt over plasmidets opbygning.
Optagelse af fremmed DNA i en bakteriecelle kaldes transformation.
Metoderne for, hvordan transformationen udføres, varierer mellem forskellige bakterier. I Biosensor Case 1 øvelsen skal du indsætte et plasmid (Case 1 plasmidet) i en E. coli bakterie. For at udføre transformationen skal du anvende varmeshock transformationsmetoden. Med denne metode behandles bakterierne først med kalcium-ioner (Ca2+), for at gøre dem kemisk kompetente (se figur 4.1). Dernæst tilsættes plasmidet til de kemisk kompetente bakterier, og de udsættes for et varmeshock, som resulterer i, at plasmidet bliver optaget i nogle af de kompetente bakterier (se figur 4.2). De bakterier, som har optaget biosensorplasmidet kaldes transformanter.
Nu har du en blanding af bakterier, som har optaget Case 1 plasmidet (transformanter), og bakterier som ikke har optaget plasmidet. Sidstnævnte kaldes vildtypebakterier, fordi de ikke har optaget nogle nye gener og altså har den oprindelige genotype. Denne blanding kalder vi for transformationsblandingen. Mekanismen for hvordan varmeshocket virker, er endnu ikke opklaret. Man har blot fundet ud af at øge transformationseffektiviteten, altså hvor mange af de kompetente bakterier, som optager plasmidet.
Transformanterne begynder nu at replikere biosensorplasmidet via ori (se figur 4.3).
Efter varmeshocket tilsættes LB-medium, som er et nærings- og energiholdigt vækstmedium. Det får alle bakterierne (både transformanterne og vildtypebakterierne) til at vokse og dele sig (se figur 4.4). Transformanterne begynder også at syntetisere det rødt fluorescerende protein og ampicillinresistensproteinet, ud fra generne på Case 1 plasmidet (se figur 4.5). Det tager dog lang tid før der er produceret nok rødt fluorescerende protein til, at det kan ses med det blotte øje.
Selektionmarkører er derfor særligt smarte, hvis genet ikke gør det nemt for dig at se forskel på bakterier, hvor transformationen er lykkedes, og hvor den ikke er.
Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, for eksempel hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder [1].
Ifølge lovgivningen skal genmodificerede planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny gen-modificeret plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der blandt andet bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed, dette kaldes også for forsigtighedsprincippet.
Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution \cite{wind}. Nogen opfatter brugen af gensplejsning som at ‘lege Gud’ og er derfor stærke modstandere. Hvis du ønsker at læse mere om bioetik, findes der blandt andet et etik interview med teolog Mickey Gjerris og professor Kasper Lippert-Rasmussen der har et meget forskelligt synspunkt på brugen af GMO [2].
I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi.
[1] Jesper Wind. Moderne genteknologi. https://www.biotechacademy.dk/ undervisning/gymnasiale-projekter/moderne-genteknologi/, 2000.
[2] Det etiske råd. Etikinterview om gmo. http://www. etiskraad.dk/etiske-temaer/natur-klima-og-foedevarer/ undervisning-til-gymnasieskolen/gmo/etikinterview, 2011.
Her finder I de øvelsesvejledninger der skal benyttes til Biosensor Case 1 øvelsen.
Biosensor Case 1 Øvelsesvejledningen skal benyttes af både underviser og elever:
Du som underviser skal også benytte følgende vejledninger:
Hvis du ønsker at lave både Case 1 og Case 2 på samme tid kan du benytte nedenståede protokol:
Her finder I opgaver, der er lavet specifikt til Biosensor Case 1 øvelsen.
Her finder I flowsheet til Biosensor Case 1 øvelsen. Vi anbefaler at flowsheetet udfyldes før I går i laboratoriet.
Hvis du ønsker at lave både case 1 og case 2 med dine elever så har vi lavet et flowsheet til når du laver begge øvelser:
Her på siden kan du finde et dokument der indeholder information omkring de tekniske deltaljer i Case 1 øvelsen. Dokumentet beskriver de forskellige elementer der indgår i Case 1 plasmidet såsom backbone samt indhold i reportergenet og aktivatorgenet. Du kan selv vælge, om du vil benytte dokumentet til undervisningen.
Indholdet i dette dokument er ikke noget eleverne bør vide for at forstå øvelsen. Det kan dog være interessant for den ekstra interessede elev at kigge nærmere på de forskellige elementer i plasmidet, og hvor de stammer fra.
Man kan downloade dokumentet her (opdateret d. 16/11 2020).
For at gøre det så let for eleverne at lave Biosensor Case 1 øvelsen har vi lavet en række videoer der viser: korrekt pipettering, udpladning af bakterier og renstrygning af bakterier. Disse videoer kan du finde her.