Case 2

Der findes flere forskellige typer af biosensorer, nogle anvender rene enzymer, antistoffer eller andre biomolekyler til at detektere det ønskede stof. Med Biotech Academy’s Biosensor kit kan du lave såkaldte “helcelle biosensorer”. En helcellebiosensor er en bakterie eller en anden organisme, som kan detektere et input og respondere med et output. Det kan bruges i mange sammenhænge f.eks. medicinske eller miljømæssige. Man kan bruge mange forskellige organismer som vært til en helcelle biosensor. Det kan for eksempel være gær eller E. coli. Disse biosensorer kan benyttes til at detektere forurenende stoffer såsom fenantren i et økosystem. En anden biosensor kan detektere riboflavin, som er et essentielt vitamin i kroppen, hvis man ikke har den rigtige mængde af riboflavin kan det f.eks. forårsage forskellige former for cancer. Hvis du er interesseret i at læse mere om biosensorer i den virkelige verden kan du læse mere på hjemmesiden (her). 

I Biotech Academy’s Biosensor Case 2 øvelse skal du lave en helcelle biosensor som som kan detektere stoffet acetylsalicylsyre. Biosensoren vil blive blålilla, når du tilsætter acetylsalicylsyre til mediet, hvor biosensor bakterien gror. Acetylsalicylsyre er det aktive stof i smertelindrende medicin som Kodimagnyl og Treo. Øvelsen har til hensigt at lære dig om transformation af bakterier, samt give dig praktisk erfaring med at arbejde med GMO-organismer og de sikkerhedsforanstaltninger der hører med. Du vil også få en forståelse for biologiens centrale dogme, altså forholdet mellem DNA, mRNA og protein.

Her kommer et kort resume af den teori, som du skal bruge for at forstå Biosensor Case 2 øvelsen. Som du måske ved er der forskel på hvordan prokayoter (bakterie) og eukayoter organismer (planter, svampe og dyr) fungerer. I følgende opfriskning snakker vi kun om prokayoter, da du i Biosensorøvelsen skal arbejde med en bakterie. Vi begynder med det centrale dogme, som starter med at DNA oversættes til mRNA. Denne proces kaldes transskription og varetages af mange forskellige proteiner bl.a. RNA-polymerasen. Næste skridt er at der ud fra mRNA-strengen laves et protein. Denne proces kaldes translation og varetages af bakteriens ribosomer, som ved hjælpe af tRNA molekyler sammensætter proteinet aminosyre for aminosyre indtil det færdige protein frigives fra ribosomet til bakteriens cytoplasma.

Gener er de områder i bakteriens DNA som, gennem det centrale dogme, bliver omsat til protein. De fleste gener i prokayoter har den samme overordnede opbygning: en promoter, et ribosomalt bindingssted, en kodende sekvens og en terminator. Figur 1 viser opbygningen af et typisk gen i prokayoter. Her kommer en lille oversigt over, hvad de enkelte genelementers funktion er:

  • Promoteren er det sted hvor RNA-polymerasen binder sig til DNA-strengen og starter transskriptionen af mRNA-strengen. Der findes forskellige typer af promotere, nogle er altid aktive, dvs. at proteinet, som dette gen koder for, hele tiden vil blive produceret. Andre promotere bliver reguleret, og er dermed kun aktive under bestemte forhold, eksempelvis ved den rette temperatur eller under tilstedeværelsen af et bestemt molekyle. Regulering af promotere lærer du mere om, hvis du laver Biosensor Case 2 øvelsen.
  • Ribosimalt bindingssted (RBS) er det sted, hvor ribosomet binder til mRNA-strengen og begynder at translatere proteinet, som genet koder for. Translationen stopper, når ribosomet når frem til et stopcodon som er det sidste codon i den kodende sekvens, se næste punkt.
  • Figur 1. Opbygningen af et gen i en prokayote organisme, for eksempel en E. coli bakterie. Du kan se at genet består af de fire genelementer: en promoter, et ribosomalt bindingssted, den kodende sekvens og en terminator. Rækkefølgen på de fire genelementer er meget vigtig for at bakterien kan producere det protein som den kodende sekvens koder for.
    Den kodende sekvens er den sekvens af DNA nukleotider som dikterer sekvensen af mRNA-strengen og dermed proteinets aminosyresammensætning og rækkefølge. Det er altså den kodende sekvens som bestemmer hvilket protein som genet koder for. Den kodende sekvens starter med et startcodon ATG og slutter med et stopcodon. Det færdige protein kommer således til at bestå af den aminosyresekvens som DNA-sekvensen mellem start og stopcodon koder for.
  • Terminatoren stopper transskriptionen ved at fortælle RNA-polymerasen, at genet er slut. Når RNA-polymerasen når frem til terminatoren slipper den DNA-strengen og frigiver mRNA-strengen til bakteriens cytoplasma.

Det kan godt være svært at forstå, hvilke genelementer som hører til transskriptionen, og hvilke som hører til translationen. Man kan huske det ved, at de yderste genelementer, promoteren og terminatoren, bruges i det første skridt i det centrale dogme nemlig transskriptionen. De inderste genelementer, ribosomalt binding sted og den kodende sekvens bruges under translationen, som er det andet skridt i det centrale dogme.

DNA findes i forskellige former dels som store kromosomer, der indeholder størstedelen af organismens gener. Bakteriers kromosomer er ofte et langt ringsluttet stykke DNA, som er i modsætning til eukayoter, hvis kromosomer ofte er et linært stykke DNA. Udover kromosomet indeholder bakterier plasmider, som er korte ringsluttede stykker DNA. Bakterier kan have gener på plasmiderne lige som på kromosomet. Når man vil tilføje et gen til en bakterie er det ofte en fordel at indsætte genet i et plasmid og derefter indsætte plasmidet ind i bakterien. Vi har indsat de nødvendige gener ind i et plasmid, så når du laver Biosensorøvelsen bliver din rolle at indsætte plasmidet ind i bakterien og teste om de indsatte gener har den ønskede effekt, for eksempel bliver bakterien rød?.

For at få lavet så mange kopiere af plasmidet som muligt indeholder plasmidet også et replikations origin (ori). Det betyder at når plasmidet er inde i en bakteriecelle vil bakterien kopiere plasmidet. ori giver bakterien mulighed for at replikere plasmidet, fordi at det fungerer som start sted for DNA-polymerasen. Her kan DNA-strengen åbne op og lade bakteriens replikationsmaskineri (DNA-polymerase, helicase, primase osv.) begynde replikationen af plasmidet. Hvis du kunne tænke dig at få opfrisket hvordan replikationen fungerer på kan se Biotech Academys Biostriben video her.

Forhåbentligt virkede det ovenstående resume bekendt. Vi har lavet en liste over emner og begreber som er gode at have styr på inden du laver Biosensorøvelsen:

  • Det centrale dogme.
  • Kendskab til E. coli bakterier som modelorganisme.
  • Plasmider
  • Varmeshock transformation
  • Genelementer: Promoter, ribosomalt bindingsted (RBS), den kodende sekvens, terminator  og replikations origin (ori)
  • Genregulering
  • Antibiotika og brugen af antibiotika som selektionsmarkør

Disse emner bør du kunne læse om i din Bioteknologibog eller kigge på Biotech Academys projekt “Moderne genteknologi”, som du kan finde her.

Biotech Academys Biostriben har også tidligere lavet videoer som forklarer nogle af emnerne. Dem kan du finde her:

I Biosensor Case 2 skal du indsætte nogle gener i en E. coli bakterie. Der findes forskellige måder at indsætte DNA i bakterier. Først og fremmest kan man indsætte en DNA-sekvens direkte ind i bakteriens kromosom. Alternativt, kan man benytte sig af et plasmid som bærer DNA-sekvensen. I denne øvelse skal du bruge et plasmid som vi kalder Case 2 plasmidet, hvor på der ligger tre gener. Først er der et såkaldt reportergen, et aktivatorgen og et kloramfenicol resistensgen. Du kan se et såkaldt plasmidkort over Case 2 plasmidet på figur 2.

Figur 2. Plasmidkort over Case 2 plasmidet. Det ses at plamidet indeholder 3 gener, samt et replikations origin (ori). Aktivatorgenet og reportergenet er forstørrede så du kan se opbygningen af de to gener.

Reportergenet

Vi starter med at tage et kig på reportergenet. Ligesom andre gener i bakterier består reportergenet af flere genelementer: En promoter, et ribosomalt bindingssted, den kodende sekvens og en terminator (se figur 2. Den kodende sekvens koder for et blålilla farveprotein AmilCP, når det produceres bliver bakterierne blålilla. Promoteren i reportergenet er dog lidt speciel, da RNA-polymeraser ikke kan starte transskription uden at få hjælpe fra aktivatorproteinet NahR og acetylsalicylsyre molekyler. Derfor vil det blålilla farveprotein som udgangspunkt ikke blive produceret, når der ikke er acetylsalicylsyre i mediet, vi ser nærmere på dette senere.

Aktivatorgenet og genregulering

Som du måske ved er det ikke alle promotere som altid er aktive. Det bruger bakterier og andre organismer til at styre hvornår de producerer forskellige proteiner. For eksempel har en E. coli bakterie gener som kan nedbryde og udvinde energien fra mange forskellige sukkerarter, f.eks. glukose og laktose. Hvis bakterien er i nogle omgivelse hvor der kun er glukose tilstede ville det være spild af energi at producere enzymer som kan nedbryde laktose. Derfor har E. coli bakterier et system som sørger for at enzymerne som nedbryder laktose kun bliver produceret når der er laktose i deres omgivelser. Dette system har du måske lært om i din bioteknologiundervisning hvis du har lært om den såkaldte lac-operon. Bakterier har mange lignende systemer som sørger for at det kun er de nødvendige proteiner som bliver udtrykt. Dette kaldes overordnet genregulering og er utrolig vigtig for alle organismer for at de bruger deres energi så effektivt som muligt. Der findes mange forskellige mekanismer som kan aktivere eller deaktivere gener på baggrund af alle mulige forhold, f.eks. tilstedeværelse af bestemte sukkerarter, temperatur og saltindhold.

Figur 3. Aktivatorgenet indeholder en konstitutiv promoter og derfor vil NahR proteinet hele tiden blive produceret. Det sker gennem det centrale dogme som illustreret på figuren.

I Biosensor Case 2 øvelsen skal du som sagt lave en biosensor som reagerer på stoffet acetylsalicylsyre. I din biosensor vil genreguleringen ske ved et sammenspil mellem aktivatorgenet og reportergenet. Aktivatorgenet består ligesom reportergenet af fire genelementer: en promoter, et ribosomalt bindingssted, den kodende sekvens og en terminator (se figur 2).

Den kodende sekvens koder for proteinet NahR (Proteiner vis navn ender på et stort “R” er oftest regulatoriske proteiner. Det kan f.eks. være en aktivator eller en repressor.) som er en aktivator for promoteren som findes i reportergenet. NahR bliver udtrykt af en konstitutiv promoter, det vil sige at den altid er “tændt”. Altså producerer biosensor bakterien hele tiden NahR proteinet (se figur 3). Umiddelbart skulle man tro at reportergenet dermed også hele tiden ville blive udtrykt, men sådan forholde det sig ikke. Det skyldes at NahR skal binde acetylsalicylsyre for at kunne aktivere reportergenet.

Figur 4. Regularingsmekanismen i Case 2 Biosensoren. Denne mekanism sørger for at det blålilla farveprotein kun bliver produceret når der er acetylsalicylsyre tilstede. Det sker ved at RNA-polymerasen kun kan starte transskriptionen af reportergenet hvis den for hjælp fra både acetylsalicylsyre og aktivatorproteinet NahR.

Man siger altså at acetylsalicylsyre fungerer som en inducer til NahR, fordi at acetylsalicylsyre “tænder” aktivatorproteinet NahR, så det kan aktivere transskriptionen af reportergenet.

Reguleringsmekanismen i acetylsalicylsyre biosensoren er ikke fuldt ud opklaret, men der eksisterer et bud på hvordan den virker. Mellem aktivator- og reportergenet findes fire kopier af en DNA-sekvens som NahR proteinet kan binde sig til (Se figur 4.1). Udover at NahR proteinet kan binde til DNA kan det også binde til acetylsalicylsyre man mener at binding af acetylsalicylsyre medfører en konformationsændring i den tertiære proteinstruktur, som gør at NahR proteinet nu også kan binde andre NahR proteiner og dermed indgå i en kvartenær struktur.

Det som forskerne mener sker er at et NahR protein binder til hver af de fire NahR-bindingssekvnserne som findes mellem aktivatorgenet og reportergenet (se figur 4.2). Dernæst binder de fire NahR proteiner hver et acetylsalicylsyre molekyle. Dette gør at NahR proteiner skifter til en konformation (se figur 4.3). Nu folder DNA strengen rundt og gør det muligt for de fire NahR proteiner at interagere to og to (se figur 4.4).

Når NahR proteinerne er bundet samme kan de interagere med RNA-polymerasen som sætter sig på promoteren i reportergenet og begynder transskriptionen (se figur 4.5). mRNA-strengen kan nu translateres til AmilCP og bakterien vil blive blålilla (se figur 4.6 and 4.7). For at opsummere, RNA-polymerasen skal bruge NahR som sidder sammen to og to for at kunne begynde transskriptionen. NahR skal bruge acetylsalicylsyre for at kunne sætte sig sammen to og to, på den måde bliver reportergenet kun udtrykt når der er acetylsalicylsyre i bakteriens omgivelser.

Biologi er dog meget sjældent stringent. Det samme gælder for reguleringsmekanismen i denne biosensor. Selv om at RNA-polymerase i teorien ikke burde kunne transskribere reportergenet, når der ikke acetylsalicylsyre er tilstede, sker det stadigvæk, men der bliver bare ikke produceret lige så meget af de blålilla farveprotein som der gør når der er acetylsalicylsyre tilstede. Dette fænomen kaldes at promoter er utæt (på engelsk at promoteren er leaky). Derfor når du laver biosensoren laboratoriet kan du godt opleve at bakterierne vil være svagt farvede allerede inden du har udpladet bakterierne på medium med acetylsalicylsyre.

Selektionsmarkør

Vi har nu beskrevet funktionen af både aktivator- og reportergenet. Det sidste gen som finde på Case 2 plasmidet koder for kloramfenicol resistens. Dette kaldes en selektionsmarkør, da det muligøre at selektere (udvælge) de bakterier som har optaget biosensor plasmider frem for de bakterier som ikke har. Udvælgelse sker ved at udplade blandingen af bakterier med og uden biosensor plasmidet på en LB-agarplade med kloramfenicol tilsat. Nu vil det kun være de få bakterier som har optaget biosensor plasmidet som kan overleve. Dette er særlig brugbart, hvis dit indsatte gen ikke giver bakterien en anden farve og gøre det nemmere at arbejde videre med den genmodificerede bakterie efterfølgende.

Origin of Replication

På Case 2 Biosensor plasmidet findes også et origin of replication (ori) dette bliver genkendt af bakteriens DNA-polymeraser som starter replikationen af plasmidet her. Således bliver der lavet flere kopier af biosensor plasmidet inde i bakteriens. Når der er flere kopier af plasmidet vil der altså være flere kopier af genet for det blålilla farveprotein. Det betyder at flere RNA-polymeraser samtidigt kan transskribere genet dermed vil der blive produceret mere af det blålilla farveprotein AmilCP jo flere kopier af plasmidet der er i bakterien. Forskellige ori kan give forskellige kopital (antal af kopier af et plasmider i hver bakterie) nogle giver kun få kopier 1-10 plasmider pr. bakterie, mens andre som f.eks. det i Case 2 Biosensor plasmidet er blevet estimeret til at give 200 – 300 kopier i hver bakterie.

Optagelsen af fremmed DNA ind i en bakterie kaldes transformation. Metoderne for hvordan transformationen udføres, varierer mellem forskellige bakterier. I Biosensor Case 2 øvelsen skal du indsætte et plasmid (Case 2 plasmidet) ind i en E. coli bakterie.

For at udføre transformationen skal du anvende varmeshock transformationsmetoden. Med varmeshock transformationsmetoden behandles bakterierne først med kalcium-ioner (Ca2+), disse bakterier siges nu at være kemisk kompetente (se figur 5.1). Dernæst tilsættes plasmidet til de kemisk kompetente bakterier og de udsættes for et varmeshock, som resulterer i at plasmidet bliver optaget i nogle af de kompetente bakterier (se figur 5.2).

Nu har du altså en blanding at bakterier som har optaget Case 2 plasmidet og bakterier som ikke har. Mekanismen for hvordan varmeshocket virker er det endnu ikke opklaret, man har blot fundet ud af at det øger transformationseffektiviteten, altså hvor mange af de kompetente bakterier som optager plasmidet. Bakterierne som har optaget Case 2 plasmidet begynder nu at replikere det via ori (se figur 5.3). Efter varmeshocket tilsættes LB-medium som indeholder en masse næring og energi, som bakterierne kan bruge til at vokse og dele sig (se figur 5.4). Ligeledes begynder bakterierne også at syntetisere NahR protein og kloramfenicol resistensproteinet ud fra generne på Case 2 plasmidet (se figur 5.5).

Figur 5. Transformationen af bakterier foregår i flere trin. Figuren her vise hvad der sker inde i bakterien på hvert trin processen. Figuren her bruger Case 1 plasmidet til at illustrere processen, men transformations processen er ens for alle Biosensor casene.

 

Figur 6. Forskellen på at bruge selektion og ikke at bruge selektion. Det kan være rigtig svært at finde de bakterier som har optaget det ønskede DNA på en LB-agarplade uden antibiotika.

Næste skridt er at selektere (udvælge) de bakterier som har optaget plasmidet det gøres ved at udplade bakterierne på en LB-agarplade med kloramfenicol tilsat. Bakterierne som har optaget Case 2 plasmidet kan overleve fordi de udtrykker kloramphenikol resistensproteinet, mens at bakterier som ikke har optaget Case 2 plasmidet vil dø.

Hvis blandingen af bakterier blev udpladet på en LB-agarplade uden kloramfenikol ville der vokse en blanding af bakterier med og uden Case 2 plasmidet på LB-agarpladen (se figur 6). Selektionmarkører er derfor særligt smarte, hvis dit gen ikke gør det nemt for dig at se forskel på bakterier hvor transformationen er lykkes og hvor den ikke er.

Dette er tilfældet i Biosensor Case 2 øvelsen da alle bakterierne vil være hvide efter transformationen.

Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, for eksempel hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder [1].

Ifølge lovgivningen skal genmodificerede planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny gen-modificeret plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der blandt andet bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed, dette kaldes også for forsigtighedsprincippet.
Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution [1]. Nogen opfatter brugen af gensplejsning som at ‘lege Gud’ og er derfor stærke modstandere. Hvis du ønsker at læse mere om bioetik, findes der blandt andet et etik interview med teolog Mickey Gjerris og professor Kasper Lippert-Rasmussen der har et meget forskelligt synspunkt på brugen af GMO [2].

I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi.

[1] Jesper Wind. Moderne genteknologi. https://www.biotechacademy.dk/ undervisning/gymnasiale-projekter/moderne-genteknologi/, 2000.

[2] Det etiske råd. Etikinterview om gmo. http://www. etiskraad.dk/etiske-temaer/natur-klima-og-foedevarer/ undervisning-til-gymnasieskolen/gmo/etikinterview, 2011.

AmilCP….

Her finder I de øvelsesvejledninger der skal benyttes til Biosensor Case 2 øvelsen.

Biosensor Case 2 Øvelsesvejledningen skal benyttes af både underviser og elever: 

Du som underviser skal også benytte følgende vejledninger: 

Her finder I opgaver der er lavet specifikt til Biosensor Case 2 øvelsen.

Her finder I det flowsheet der lavet specifikt til Biosensor Case 2 øvelsen. 

Her på siden kan du finde et dokument der indeholder information omkring de tekniske deltaljer i Case 2 øvelsen. Dokumentet beskriver de forskellige elementer der indgår i Case 2 plasmidet såsom backbone samt indhold i reportergenet og aktivatorgenet, man kan selv vælge om man vil benytte dokumentet til undervisningen. 

Det skal dog siges at indholdet i dette dokument ikke er noget som eleverne bør vide for at forstå øvelsen, det kan dog være interessant for den ekstra interessede elev at kigge nærmere på de forskellige elementer  plasmidet og hvor de stammer fra. 

Man kan downloade dokumentet her (opdateret d. 6/11 2019).

Scroll til toppen

Vi bruger cookies for at kunne give dig den bedste oplevelse. Ved at bruge vores side accepterer du brugen af cookies.